AxyPrep 無內毒素質粒大量試劑盒
本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,結合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA。同時采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除內毒素,可從 80-200 ml 細菌培養物中提取出多至 500 礸 高純度質粒 DNA,其內毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下。
一、 試劑盒組成、貯存、穩定性
| Cat. No. | AP-MX-EP-2 | AP-MX-EP-10 | AP-MX-EP-25 | |||
| 制備次數 | 2 preps | 10 preps | 25 preps | |||
| 制備管(Maxiprep column) |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
| 大量濾器(Maxiprep syringe filter) |
| 2 |
| 10 |
| 25 |
| RNase A | 48 µl | 270 µl | 700 µl | |||
| Buffer S1 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer S2 | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer S3K | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer B | 24 | ml | 115 | ml | 285 | ml |
| Buffer W1 | 3 | ml | 160 | ml | 350 | ml |
| Buffer W2 concentrate | 15 | ml | 66 | ml | 150 | ml |
| ET-free water (70% Ethanol) | 1.8 | ml | 7.5 | ml | 18 | ml |
| Eluent A | 8 | ml | 30 | ml | 70 | ml |
| Buffer ETR | 10 | ml | 50 | ml | 120 | ml |
| Buffer PF | 3 | ml | 13 | ml | 30 | ml |
| 說明書 |
| 1 |
| 1 |
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RNase A:50 mg/ml,室溫可貯存 6 個月,長期貯存于-20℃。
Buffer S1:細菌懸浮液。加入 RNase A 后,混合均勻,4℃貯存。
Buffer S2:細菌裂解液(含 SDS/NaOH),室溫密閉貯存。
Buffer S3K:中和液,室溫密閉貯存。
Buffer B:DNA 結合溶液,室溫密閉貯存。
Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%
乙醇)?;旌暇鶆?,室溫密閉貯存。
ET-free water (70% Ethanol):使用前,按試劑瓶上的體積加入無水乙醇(可用無水乙醇或 95%
乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。
Eluent A:洗脫液。室溫密閉貯存。
Buffer ETR:內毒素去除液。室溫密閉貯存。
二、 注意事項
1.細菌過量將影響細菌裂解、質粒 DNA 的釋放,導致內毒素含量過高。
2.步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分,否則影響得率。
3.在加入 Buffer S3K 時,蛋白質和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,必須充分混合均勻,使凝集塊中間也得到充分中和凝結。
4.Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和防護眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣物,謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時,要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,必要時尋求醫療咨詢。
三、 實驗準備
1.*次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃貯存。
2.*次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入體積的無水乙醇。
3.*次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無水乙醇。使用前置于-20℃預冷。
4.使用前,檢查 Buffer S2 是否出現沉淀,如出現沉淀,應于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用。
5.Eluent A 在 65℃預熱后使用,有利于提高質粒得率。
6.Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃預冷。
7.準備無核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、50ml 離心管。
8.水平離心機(轉速可達到 4,000×g)及冷凍離心機(轉速可達到 8,000×g)
9.準備 56℃水浴。
Buffer PF:分相緩沖液。室溫密閉貯存。
四、 操作步驟
AxyPrep無內毒素質粒大量試劑盒
1.取 80-200 ml 在 LB 培養基中培養過夜的菌液(若使用豐富培養基,菌液體積應減半或更少),3,000 ×g 離心 8 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,除盡上清。
一般過一夜培養的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4,菌量需減少。
2.加 10 ml Buffer S1,懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應留有小的菌塊。
確認 Buffer S1 中已加入 RNase A。
3.加 10 ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過 5 min。
Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。
避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。
此步驟不宜超過 5 min。
4.加 10 ml 4℃預冷的 Buffer S3K,溫和并充分地上下翻轉混合,直至溶液顏色均一并形成緊實的凝集塊,室溫放置 5 min。
加入 Buffer S3K 后應立即混合,以避免形成局部的凝結塊。
避免劇烈搖晃,否則將導致基因組 DNA 污染。
5.加 10 ml 4℃預冷的 Buffer B,溫和并充分地上下翻轉混合 10 次,8,000×g 離心(4℃)10 min。
步驟 6-9 可以選擇離心法或負壓法。
A.離心法:
6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液,轉移到大量濾器(Maxiprep
syringe filter)中。
7A. 插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。 8A. 棄濾液,加 12 ml Buffer W1 至制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。
9A. 棄濾液,加 14 ml Buffer W2 至制備管中,≥6,000×g 離心 5 min。
確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
B.負壓法:
6B. 正確連接負壓裝置,將大量制備管插到負壓裝置的插口上。
7B. 吸取步驟 5 中的上清液,轉移到大量濾器中,插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,開啟并調節負壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。
8B. 保持負壓,加 12 ml Buffer W1,吸盡管中溶液。
9B. 保持負壓,加 14 ml Buffer W2,吸盡管中溶液。
確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。
10.再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2,≥6,000×g 離心 5 min。
11.將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中,在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,室溫靜置 5 min,≥6,000
×g 離心 5 min 收集質粒 DNA。
將 Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。
12.棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預冷的 Buffer ETR,混合均勻。
如果 Buffer ETR 渾濁,于冰上靜置,直至溶液變得清亮;如果分層,則混合均勻。
13.加入 1 ml Buffer PF,混合均勻。
*溶液可能會出現微弱的渾濁現象,此為正?,F象。
14.置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min。
孵育后溶液將出現大量乳白色沉淀,否則延長孵育時間。
孵育后溶液有可能出現分層現象,此為正?,F象。
此步驟的離心必須使用吊籃式(swing-out rotor)離心機或其他水平離心機
15.取無色上相至 50 ml 離心管中,加入 0.8 倍體積異丙醇(如:取得 6 ml 無色上相,則加入 4.8 ml 異丙醇),混合均勻。室溫靜置 10 min。8,000×g 離心 10 min。
16.盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預冷的 ET-free water(70% Ethanol),洗滌沉淀,8,000×g 離心 5 min。
ET-free water(70% Ethanol)使用前確定已加入體積的無水乙醇。
AxyPrep無內毒素質粒大量試劑盒
17.盡可能棄盡上清。在超凈臺中干燥 10-15 min。
管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。
18.加入 500 祃 Eluent A 或無內毒素水溶解質粒 DNA。