貨號:YC1131 規(guī)格:100管/96樣
糖原含量試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
糖原是由葡萄糖單位構(gòu)成的高分子多糖,是糖的主要的儲存形式之一,主要貯存在肝和肌肉中作為備用能量,分別稱為肝糖原和肌糖原。肝糖原可調(diào)節(jié)血糖濃度,當(dāng)血糖升高時可在肝臟合成糖原,血糖降低時,肝糖原則分解為葡萄糖以補(bǔ)充血糖。因此,肝糖原對維持血糖的相對平衡十分重要。肌糖原是肌肉中糖的儲存形式,在劇烈運(yùn)動消耗大量血糖時,肌糖原不能直接分解成血糖,必須先分解產(chǎn)生乳酸,隨血液循環(huán)到肝臟,通過糖異生轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚱咸烟恰?/span>
糖原含量試劑盒測定原理:
蒽酮法。利用強(qiáng)堿性提取液提取糖原,在強(qiáng)酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量。需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、濃硫酸(不允許快遞)和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:0.1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 10mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1 瓶, 4℃保存;
糖原含量試劑盒提取:
1﹑細(xì)胞或細(xì)菌:收集500~1000萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;加入0.75mL提取液超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);轉(zhuǎn)移至10mL試管中,95℃水浴20min(蓋緊,防止水分散失),隔5min振搖試管1次,使充分混勻;取出試管冷卻后,用蒸餾水定容到5ml,混勻,8000g 25℃離心10min,取上清液待測。
2﹑組織:稱取0.1~0.2g樣品,加入0.75ml 提取液充分勻漿;轉(zhuǎn)移至10ml試管中;95℃水浴 20min(蓋緊,防止水分散失),隔5min振搖試管1次,使充分混勻;待組織全部溶解后,取出試管冷卻后,用蒸餾水定容到5ml,混勻,8000g 25℃離心10min,取上清液待測。
測定步驟
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至620nm,蒸餾水調(diào)零。
2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95℃。
3、試劑二工作液的配制:在試劑二中倒入6mL蒸餾水,緩慢倒入24mL濃硫酸,充分溶解混勻后使用;用不完的試劑4℃保存一周;
4、加樣表(在 EP 管中反應(yīng)) :
試劑(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測定管 |
待測樣本 |
|
| 60 |
試劑一 |
| 60 |
|
蒸餾水 | 60 |
|
|
試劑二 | 240 | 240 | 240 |
混勻,置95℃水浴10min(蓋緊,防止水分散失),冷卻,取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96孔板中,于620nm波長處,分別讀取空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管吸光度,分別記為 A1、A2 和 A3。
注意:1、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要測一次。
2、如果 A3-A1大于2,需要將樣本用蒸餾水稀釋,計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
糖原含量的計算:
1、按照樣本質(zhì)量計算
糖原(mg/g 鮮重)=1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)
= 0.555×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W
2、按照蛋白質(zhì)含量計算
糖原(mg/mg prot)=1.11×(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷(V1×Cpr)
=0.111×(A3-A1) ÷(A2-A1) ÷Cpr
1.11:是此法測得葡萄糖含量換算為糖原含量的常數(shù),即 111ug 糖原用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于100ug 葡萄糖用蒽酮所試劑顯示的顏色;C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.1mg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中待測樣本體積,0.06mL;V2:加入提取液體積,5mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。
注意:低檢測限為 10ng/g 鮮重或 0.1ng/ mg prot 。