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使用Sanger測序檢測5%的體細胞變異

低頻突變是指對于特定等位基因突變比率少于25%的單核苷酸多態性(SNP)，低水平體細胞變異檢測對腫瘤、傳染病、遺傳病等很多研究領域都非常關鍵。Applied Biosystems™ Minor Variant Finder軟件是一款針對Sanger測序檢測和報告低頻突變的需要而開發的新型軟件。通常此類低頻變異的拷貝數非常低，而Minor Variant Finder軟件具有更高的檢測靈敏度，確保Sanger測序成為腫瘤學家和病理學家檢測低頻(5%或更低)體細胞變異的理想選擇。

根據具體的癌癥類型，使用Minor Variant Finder軟件和金標準的Sanger測序，可以簡便快速的檢測出癌基因(例如KRAS，NRAS等)和抑癌基因(例如TP53)的相關變異數，也是驗證二代測序(NGS)檢測結果的重要方法。

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可檢測低至5%的低頻突變 Minor Variant Finder軟件的創新算法在于使用一個對照樣本扣除背景噪音，可檢測低至5%的低頻突變。通過該軟件限度的降低噪音，導入的Sanger測序數據可形成清晰的電泳圖譜，因此可以直觀的驗證這些低頻變異。該軟件還設置了各種評審指標，有助于在分析之后檢測出任何可能的低頻變異。正向和反向均可檢測到低頻變異，進而驗證相關結果。

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更低的成本測序，1到96個靶標擴增子 檢測有限數量的靶標時，Sanger測序是較為經濟的選擇。Minor Variant Finder軟件具有更高的檢測靈敏度，確保Sanger測序成為腫瘤學家和病理學家檢測低頻(5%或更低)體細胞變異的理想選擇。此外，該軟件也提供了一種對固定的基因試劑盒進行擴展的簡單、靈活方法。

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更快獲得關鍵結果 充分利用Sanger測序快速獲得結果的優勢，從樣本到結果可在一天內完成——讓您更快獲得關鍵結果。

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使用比對視圖和維恩圖，驗證NGS結果 對于使用NGS技術的高通量實驗室，NGS結果中的輕微變異可通過Sanger測序驗證，此方法快速且成本低廉。驗證結果可通過比對視圖和維恩圖直觀顯示。

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簡單的工作流程 該軟件不需要您變更現有工作流程，可與您實驗室現有的Sanger測序工作流程兼容。

 

使用毛細管測序儀、Minor Variant Finder軟件檢測低頻突變

序言

使用下一代測序儀和數字PCR進行低頻突變基因的篩選和檢測，在臨床領域的應用受到越來越多的關注。通過超多重PCR擴增技術和新—代測序儀的Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2，僅使用10ng DNA即可—次篩查約2800種突變，通過正常讀取數據和突變讀取數據直接比對，可以計算突變率。另— 方面，使用經典Sanger測序時，難以檢測出低于25%的低頻突變。而本篇文章中介紹的Applied biosystems™ Minor Variant Finder軟件，可通過毛細管測序儀，檢測出低至5%的低頻突變。同時，為了驗證該軟件所檢測的突變，同時結合數字PCR (dPCR)方法加以驗證。而且，在千葉縣癌癥中心臨床染色體組研究部橫井佐奈部長的大力協助下，我們還嘗試使用臨床樣本，檢測EGFR基因的低頻突變。

 

Minor Variant Finder軟件 

Minor Variant Finder (MVF)軟件是—款為使用毛細管測序儀、檢測低至5%的低頻突變而開發的新型軟件。傳統毛細管測序儀的軟件，是根據突變峰高與主峰高的比值進行檢測，可檢測25%左右的突變率。而低頻突變的突變峰值隱藏在測序數據的背景噪音中，難以檢測。

MVF軟件中搭載依托Applied Biosystems長期使用并被的測序算法。通過扣除背景噪音信號，可通過對照樣本中區分出背景噪聲，目視檢測出突變峰值。從而檢測出過去難以識別的，低至5%突變的峰值。而且，該軟件可讀取新一代測序儀的vcf文件，從而比對新一代測序儀和毛細管測序儀的結果，并對檢測到的突變加以注解。不僅如此，無需更改以往的實驗流程即可使用新型MVF軟件。使用毛細管測序儀的檢測文件(.ab1文件)，分析更簡單。

方法及材料 

1. 毛細管測序儀

為驗證突變，使用人工基因合成服務lnvitrogen™ GeneArt™ Strings™ DNA Fragments，人工合成包括人體EGFR Exon21區域在內的600bp的DNA (圖4)。合成含有野生型和突變型兩種基因 (COSMIC 6213)的樣本， 分別混合成突變型比例為2.5%、5%、10%、20%、50% 的樣本。使用Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，樣品量6ng,  正向引物及反向引物3.2pmol 的條件下，進行循環測序反應 。使用Applied Biosystems™ BigDye™ XTerminator™純化試劑盒純化后，在Applied Biosystems™ 3500xL基因分析儀上，使用POP-7™聚合物、50cm毛細管陣列進行電泳。MVF軟件處理所得數據，檢測突變。

2. 數字PCR

使用Applied Biosystems™ QuantStudio™3D數字PCR系統，驗證dPCR方法的突變頻率。把同—樣本進行倍比稀釋，得到104份重復樣品，使用QuantStudio 3D預混液及Applied Biosystems™ TaqMan™SNP基因分型檢測體系(檢測ID:C_172767645_10)，進行反應。

結果分析 

使用MVF軟件分析毛細管測序儀生成的數據，可以檢測出2.5%~50%的所有混合樣品的突變堿基峰值。結果中顯示所檢測到的突變，并可以立即確認所檢測的突變位 置信息和突變信息。另外，通過—鍵點擊，可確認檢測的突變峰值的詳細信息(圖6A-C)。將檢測到的突變，匯總整理為基于峰高的突變率，如表1所示。由于ddNTP 的擴增效率和所標識的熒光物質強度不同等原因，毛細管測序儀中沒有峰高的定量指標，所以基于峰高的突變率和dPCR結果有些許差異。但是，通過使用MVF軟件，可以檢測以往無法檢測到的2.5%突變樣本。另外，雖然沒有嚴格的定量指標，但仍可以看出基于峰高的突變率隨著突變型混合比例減少而減少。

這次的實驗中，可以檢測出包括2.5%這種極低頻率在內的所有突變，無任何假陰性。

另—方面，5個樣本中共計檢測出11個突變峰值，其中有6處判定為假陽性。其突變率低至百分之幾，且在正向結果和反向結果中超過幾倍的差異，其原始數據在該位置噪音較大(圖6)。MVF軟件可以直接根據各自的峰值，并做出判斷，所以可以成為偏離正向和反向的突變率及原始數據噪音大小的判斷依據。

在千葉縣癌癥中心臨床染色體組研究部橫井佐奈部長的大力協助下，對人體樣本也進行了相同的突變檢測。結果顯示MVF也可檢測出人體DNA樣本的突變。

 

結論  

通過使用MVF軟件，可以從人工合成樣本和實際人體DNA樣本中，檢測出傳統軟件難以檢測的低于25%的突變。另外，在本次驗證試驗中，甚至可以毫無遺漏的檢測到包括2.5%這種極低突變頻率在內的所有低頻突變。綜上，展示了本軟件在新—代測序儀的突變數據驗證和癌癥研究中低頻突變的檢測等染色體組的研究中的實用性，也期待本軟件可以幫助我們進—步提高研究的精度和效率。