為什么研究線粒體
線粒體在健康和疾病中發揮著關鍵作用，不僅是能量產生的關鍵，還有很多其他功能 [1]：
離子穩態：從鐵和鈣的穩態到激素和神經遞質的產生，都離不開線粒體。特別是在鈣穩態中，線粒體作為調節者、緩沖池和傳感器參與細胞內鈣信號傳導。線粒體可以儲存和釋放鈣，從而影響細胞質中鈣峰值的形狀、頻率和幅度，這對于各種細胞過程都緊密相關。
胞內、胞外交流：線粒體與其他細胞器和環境相互作用，影響各個生理層面的交流。線粒體是細胞間通訊的核心，在復雜的調節活動和細胞間通訊中充當信號細胞器。線粒體與細胞核之間的信號轉導通路，在細胞穩態中扮演關鍵角色。
免疫系統：線粒體可調節免疫細胞的功能及其對感染的反應。線粒體負責產生免疫細胞激活、增殖和行使功能所需的能量。線粒體還參與活性氧的產生，這對于免疫細胞的抗菌能力相當重要。此外，線粒體還參與免疫細胞死亡和炎癥的調節。位于線粒體外膜上的線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）在病毒感染的免疫反應中至關重要。因此，線粒體健康與免疫系統功能息息相關。
腸道微生物群：腸道微生物群可以影響線粒體新生，從而影響能量產生和其他線粒體功能。線粒體可以通過產生活性氧和其他代謝物來影響腸道微生物群的組成。線粒體和腸道微生物群之間的這種相互作用對于維持腸道健康來說是非常重要的，并且與多種疾病有關，包括代謝綜合征、炎癥性腸病和神經退行性疾病。
生物鐘：據文獻報道，線粒體活動和動態會影響晝夜節律，并且線粒體與晝夜系統相互作用以調節 NAD+ 等關鍵分子的生物合成。
線粒體功能障礙與疾病的關系
線粒體功能障礙與多種疾病相關，包括代謝綜合征、神經系統疾病、癌癥、心血管疾病、傳染病以及炎癥性疾病，下面是幾個例子：
代謝綜合征：線粒體功能障礙可能導致代謝綜合征，這種疾病的特征包括高血壓、高血糖和水平異常等一系列癥狀，這些疾病會增加患心臟病、中風和二型糖尿病的風險。
神經系統疾病：線粒體功能障礙與阿爾茨海默病、帕金森氏癥和肌側索硬化 (ALS) 等神經系統疾病有關。線粒體功能障礙可能導致能量產生減少和活性氧產生增加，從而導致神經元損傷。
癌癥：線粒體代謝的改變可能導致癌癥的發生和發展。線粒體功能障礙會導致活性氧產生增加，從而導致 DNA 損傷和突變，促進癌癥的發展。
心血管疾病：線粒體功能障礙可能會損害心肌產生能量的能力，從而導致心臟疾病，包括心力衰竭、心律失常和其他心血管疾病。
炎癥性疾病：線粒體功能障礙可引發慢性炎癥，導致各種炎癥性疾病的發展，包括自身免疫性疾病。
線粒體研究的工具
線粒體形態&定位研究
根據樣品類型和具體應用，線粒體結構標記匯總如下：
MitoTracker 標記探針
MitoTracker 探針是小分子 (<1 kDa)、細胞滲透性線粒體選擇性染料，含有硫醇反應性氯甲基，部分探針可在固定后保持染料與線粒體結合。由于探針與線粒體硫醇形成共價鍵，因此它們只能用作終點測定，以檢測活細胞的線粒體膜電位，不能隨時間動態檢測線粒體膜變化。
圖1. 在A549細胞中使用 MitoTracker™ Red CMXRos (貨號 M7512) 染色線粒體
CellLight熒光融合蛋白
當需要在活細胞中不依賴于膜電位標記線粒體并跟蹤細胞的行為動態時，推薦使用 CellLight 試劑，操作簡單、可與其他試劑共用，也可以固定。
圖2. 在HeLa細胞中使用CellLight™ Mitochondria-GFP (貨號C10600) 標記線粒體
線粒體蛋白抗體
線粒體標記抗體特異性檢測線粒體蛋白，可以幫助研究線粒體的形態和動力學以及其他相關的生理病理狀態。常見的線粒體靶點有氧化酶（COX），氫離子轉運ATP酶線粒體F1復合體，熱休克蛋白60，抗增殖蛋白Prohibitin等。
圖3. 在印度麂鹿皮成纖維細胞中用小鼠抗 OxPhos Complex V 抑制劑蛋白抗體標記線粒體，搭配二抗 Alexa Fluor™ 555 山羊抗小鼠 IgG (貨號 A21422)
線粒體功能分析
線粒體的損傷包括線粒體氧化還原電位和膜電位的變化，后者是線粒體健康的一個核心特征。
線粒體內膜電位對Ca2+的吸收和儲存、活性氧的產生和解毒作用至關重要，其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP [2]。
因此，膜的去極化是評價線粒體功能障礙的良好指標，這與藥物毒性的相關性越來越高 [3-7]。
膜電位的變化，以及ATP與ADP比率的降低、線粒體基質鈣水平的增加、氧化應激和胞質的釋放均被認為與線粒體膜通透性轉換有關，線粒體膜通透性轉換孔 (MPTP) 可以改變離子和小分子的穩態。
線粒體功能的破壞可以使用各種熒光試劑盒來檢測，包括線粒體鈣、超氧化物、線粒體膜通透性轉換和膜電位的檢測。
線粒體膜電位動態變化的檢測
線粒體膜電位的終點檢測
線粒體超氧化物生成的檢測
細胞超氧化物生成的增加與多種疾病狀態有關 [8]。它是氧化磷酸化的副產物，因此提供了另一種評估線粒體健康和細胞狀態的方法。
圖4. 在U2OS細胞中用MitoSOX™ Green (貨號M36005) 檢測線粒體超氧化物
線粒體鈣離子檢測
線粒體Ca2+ 濃度升高在啟動程序性細胞死亡（凋亡）以及其他細胞水平的過程中起著重要作用 [9]。熒光探針在結合Ca2+ 時表現出光譜響應，使研究人員能夠使用熒光顯微鏡、流式細胞分析和熒光光譜法研究細胞內游離Ca2+ 濃度的變化。
圖5. 線粒體鈣水平和動力學的多參數成像。（A）用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2 AM在37℃下標記HeLa細胞15分鐘，成像時間超過100秒。（B–D）為區域（A）放大的圖像，展示隨著時間的推移，單個細胞內的單個線粒體。（C，D）當用10μM組織胺處理后，鈣從內部被釋放出來。Rhod-2橙紅色熒光的增加揭示了線粒體緊鄰鈣釋放的位置。（C）中的箭頭表示線粒體可能損害了鈣吸收，如果單獨使用Rhod-2 AM檢測，可能會遺漏這一細節。星號表示單個線粒體，顯示鈣水平暫時升高。
線粒體膜通透性轉換孔變化的檢測
線粒體膜通透性轉換孔 (MPTP) 是位于線粒體內外膜的非特異性通道，研究表示，參與細胞死亡過程中線粒體成分的釋放。MPTP的開關極大地改變了線粒體的滲透性以及線粒體膜電位。這種持續孔隙激活是由線粒體Ca2+ 超載、線粒體氧化、線粒體活性氧水平升高和其他促凋亡條件引起的。
參考文獻
1) Casanova, A., Wevers, A., Navarro-Ledesma, S., & Pruimboom, L. (2023). Mitochondria: It is all about energy. Frontiers in Physiology, 14.
2) Nicholls, DG (2004) Mitochondrial Membrane Potential and Aging. Aging Cell 3: 35-40.
3) Tirmenstein, MA, Hu, CX, Gales TL, et al.(2002) Effects of Troglitazone on HepG2 Viability and Mitochondrial Function Toxicol. Sci.69: 131-8.
4) O'Brien PJ, Irwin W, Diaz D, et al.(2006) High Concordance of Drug-Induced Human Hepatotoxicity With in Vitro Cytotoxicity Measured in a Novel Cell-Based Model Using High Content Screening. Arch Toxicol 80: 580-604.
5) Dykens JA, Will Y. (2007) The Significance of Mitochondrial Toxicity Testing in Drug Development. Drug Discovery Today 12:777-85.
6) Dykens JA，Jamieson JD，Marroquin LD，et al .(2008) In Vitro Assessment of Mitochondrial Dysfunction and Cytotoxicity of Nefazodone, Trazodone, and Buspirone. Toxicol Sci 103: 335-45.
7) Abraham VC, Towne DL, Waring JF, et al.(2008) Application of a High-Content Multiparameter Cytotoxicity Assay to Prioritize Compounds Based on Toxicity Potential in Humans. J Biomol Screen 13: 527-37.
8) He L, He T, Farrar S et al.(2017) Antioxidants Maintain Cellular Redox Homeostasis by Elimination of Reactive Oxygen Species. Cell Physiol Biochem 44: 532-553.
9) Giorgi C, Romagnoli A, Pinton P et al.(2008) Ca2+ Signaling, Mitochondria and Cell Death. Curr Mol Med 8: 119-130.
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