UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝
與常規的非變性細胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質。從常規緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質功能的情況下能實現高效地提取，有利于對脂筏等蛋白質的功能分析。

UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA緩沖液

 

 

　　與常規的非變性細胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質。從常規緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質功能的情況下能實現高效地提取，有利于對脂筏等蛋白質的功能分析。

　　※本產品僅限于研究用。不可用于臨床治療。

 

 

◆細胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）

 

　　裂解細胞進行蛋白質功能分析的時候，經常會使用RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）緩沖液和1% Triton X-100緩沖液等的相對溫和的細胞膜裂解緩沖液。這些緩沖液對蛋白質的構造和功能的影響小，適用于酶活性試驗、免疫沉降和各種結合實驗等蛋白質的功能分析。另一方面，與具有很強的蛋白質變性作用的SDS緩沖液相比，增溶能力較弱，*不能溶解以脂筏（Lipid Raft）為主的細胞膜組分。許多表面活性劑都不能溶解脂筏，故其又被稱為Detergent Resistant Membrane (DRM）。DRM中所含蛋白質的功能分析被認為是十分困難的。

 

 

　　脂筏（Lipid Raft）是由膽固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI錨定蛋白（GPI anchor protein）和棕櫚酰化（palmitoylation）蛋白質組成的細胞膜構造，被認為是整合各種功能蛋白的功能域。神經細胞突觸和免疫細胞的免疫突觸是脂筏的代表性例子。

 

脂筏示意圖

 

 

◆特點

 

●	操作簡單，能快速提取脂筏蛋白
●	使用兩種類型的緩沖液（A buffer，B buffer）進行兩個階段的提取。先提取出胞漿蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白
●	Buffer提取的任何蛋白質都不會失活
●	A buffer和一般的RIPA buffer成分相同＊。B buffer含有表面活性劑，可以通過透析除去
●	適用于哺乳動物細胞/組織
●	使用本品配制的溶解液適用于酶活性試驗、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA法）、SDS-PAGE和Western blot等
＊	1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium  Deoxycholate

 

 

◆緩沖液套裝組成

 

　　●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

　　●　B buffer（10 mL）

 

 

◆使用方法

 

1、	用A buffer溶解組織或培養細胞。
※	為了提高溶解效率，推薦使用均質或超聲波破碎設備。
2、	進行離心分離，使A buffer中可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀）分離，分別回收。上層清液A  buffer可溶性組分中主要含有胞漿蛋白和非脂筏蛋白。
3、	往沉淀的A buffer 不溶性組分中加入B buffer，形成懸濁液。
4、	進行離心分離，與步驟2一樣分離出可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀），分別回收。上層清液的B buffer可溶性組分中含有脂筏蛋白。
5、	可應用于各種實驗。
※	A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白質定量。蛋白質定量請使用BCA檢測。
※	使用本品A buffer和B buffer進行兩個階段的提取是最適宜的，也有只對細胞使用B buffer進行溶解和提取的例子。具體請參照以下例子。

 

 

 

UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比較

	蛋白分離			蛋白結構	蛋白功能	應用
	胞質蛋白	膜蛋白
		非脂筏蛋白	脂筏蛋白
＞1%SDS buffer	○	○	○	╳	╳	SDS-PAGE
RIPA buffer	○	○	╳	○	○	酶分析法測定 免疫沉淀 SDS-PAGE等
UltraRIPA	○	○	○	○	○

 

 

◆應用例

 

從脂筏中提取總蛋白

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer進行提取。提取后的總蛋白用SDS-PAGE/銀染色檢測（左），用BCA法定量蛋白質（右）。相對于具有很強的蛋白質變性作用的2% SDS緩沖液，UltraRIPA kit能夠提取70%以上的蛋白質。

　　※不能保證全部蛋白質的可溶性都得到改善。

 

 

脂筏標記蛋白的提取

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer，提取后進行SDS-PAGE。利用對應脂筏標記蛋白的抗體進行Western blot檢測。

 

 

 

脂筏標記蛋白的免疫沉淀

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分，通過B buffer提取脂筏標記蛋白。對 buffer提取物使用脂筏標記蛋白PSD95的抗體和G蛋白偶聯磁珠進行免疫沉淀。使用銀染色和抗PSD95抗體通過Western blot檢測進行確認。

 

 

 

提取的蛋白質的酶活性測定

 

　　用1%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO細胞，測定溶解物中乳酸脫氫酶（LDH）的活性。2%SDS具有很強的蛋白質變性作用，在幾乎*失活的情況下，1% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。

 

 

 

從脂筏中提取功能蛋白

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分。用A buffer分三次沖洗不溶性組分，消除RIPA可溶性組分中脫磷酸酶的活性。往不溶性組分中分別添加2% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和B buffer，測定各種提取物的總脫磷酸化酶活性。下圖是各緩沖液從RIPA不溶性組分中提取的蛋白質的量（左軸：黑）和所檢測的脫磷酸酶的活性（右軸：紅）的示意圖。2% SDS buffer能夠從RIPA不溶性組分中很好地提取蛋白質，但容易導致蛋白質變性，*失去脫磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白質，活性也無法檢測。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白質大約為2% SDS buffer的70%，且可以檢測出較強的脫磷酸化活性。

 

UltraRIPA kit B buffer單獨提取脂筏蛋白的可能性評價

※數據提供：東京大學藥學院研究生院保健化學系

 

　　用PBS沖洗COS-1細胞，分別使用SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解，通過離心分離（14,000 rpm, 5 min,4℃）可溶性組分和不可溶性組分。不可溶性組分用等量的SDS-PAGE樣品緩沖液變性溶解。脂筏標記Flotilin1的可溶部分通過SDS-PAGE/western blot測定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer，大部分的Flotilin 1不溶性膜組分沒有被溶解，而UltraRIPA kit B buffer幾乎可以全部溶解。

 

 

 

◆各buffer組成

 

●	SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）
●	UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate)
●	UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
●	1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）

 

 

◆產品列表

 

產品列表	產品名稱	規格
F015	UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝	1kit

 

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